抗體親和力成熟（antibody affinity maturation）是動(dòng)物免疫系統(tǒng)擁有的一種免疫功能狀態(tài)。在體液免疫中，再次應(yīng)答所產(chǎn)生抗體的平均親和力高于初次免疫應(yīng)答，這種現(xiàn)象稱為抗體親和力成熟。其作用原理是由于抗體形成細(xì)胞本身的基因突變和抗原對(duì)B細(xì)胞克隆的選擇性激活。動(dòng)物免疫系統(tǒng)的這種功能狀態(tài)是長期進(jìn)化和對(duì)外界環(huán)境不斷適應(yīng)的結(jié)果，對(duì)防御和維持自身免疫監(jiān)控有著十分重要的意義。

單克隆抗體已廣泛地應(yīng)用于臨床治療。目前，單克隆抗體的研發(fā)主要基于雜交瘤細(xì)胞或者體外抗體庫，通過抗原和抗體親和力篩選和功能驗(yàn)證，得到有藥用潛力的抗體。在實(shí)際研發(fā)過程中，經(jīng)過常規(guī)篩選所得的抗體，有諸多方面需要更細(xì)致的改進(jìn)，包括親和力、免疫原性、半衰期等?？贵w親和力的提高有助于改善抗體的特異性和效力，有助于減少用藥劑量，降低毒副作用等。發(fā)展抗體體外親和力成熟的技術(shù)，不僅能夠促進(jìn)抗體藥物的研發(fā)和質(zhì)量改善，同時(shí)也能幫助我們更好地理解抗體與抗原靶點(diǎn)相互作用的機(jī)理，更好地認(rèn)識(shí)抗原靶點(diǎn)的功能。

基于抗體庫的抗體體外親和力成熟與基于體外抗體庫的抗體篩選沒有本質(zhì)差別，都是體外篩選高親和力抗體，其重點(diǎn)主要是兩個(gè)方面，即抗體庫的構(gòu)建和篩選系統(tǒng)的選擇。區(qū)別在于，抗體篩選所用的抗體庫在構(gòu)建或合成時(shí)無偏向性，而抗體體外親和力成熟所用的抗體庫是基于確定的抗體序列模板所構(gòu)建。

針對(duì)抗體體外親和力成熟的建庫策略可以大致分為兩個(gè)類別：一類是構(gòu)建大的抗體庫，將抗體互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR區(qū)域)甚至整個(gè)V區(qū)做隨機(jī)突變；另一類是構(gòu)建小的抗體庫，將突變集中于抗體序列上特定的區(qū)域。 抗體大庫構(gòu)建的方法主要有：CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling、error-prone PCR等。（1）CDR walking是分段隨機(jī)突變同時(shí)保證相鄰兩個(gè)突變區(qū)域有所重疊，從而使突變覆蓋整個(gè)CDR區(qū)域。（2）Chain shuffling是將抗體的VH和VL的配對(duì)重新洗牌。（3）DNA shuffling是將抗體V區(qū)的序列重新洗牌，其突變不限于CDR區(qū)，也包括FR區(qū)域。（4）error-prone PCR則是對(duì)抗體進(jìn)行隨機(jī)突變。這些方法所構(gòu)建的庫的容量較大，工作量也較大。 與抗體大庫的構(gòu)建相比，抗體小庫構(gòu)建更有序列針對(duì)性。（1）可以選擇對(duì)抗體重鏈CDR3區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變，因?yàn)橹劓?CDR3區(qū)域被認(rèn)為通常對(duì)抗原抗體結(jié)合起關(guān)鍵作用。（2）另一種方法可以在抗體輕鏈和重鏈的6個(gè)CDR區(qū)域的所有氨基酸上進(jìn)行突變，每一個(gè)氨基酸分別被突變成其他19個(gè)氨基酸（飽和突變），構(gòu)成抗體飽和突變庫。通過篩選抗體飽和突變庫，可以識(shí)別出高親和力的突變熱點(diǎn)。通過組合這些突變熱點(diǎn)，構(gòu)建一個(gè)組合突變庫，再進(jìn)行篩選可以找到具有更高親和力的組合。這種方法可以提高篩選效率，有效獲得高親和力抗體序列。（3）胚系基因熱點(diǎn)（germline hotspots）是體細(xì)胞高頻突變過程中的優(yōu)先突變區(qū)域，幾乎都處于CDR區(qū)域內(nèi)部，對(duì)抗體的親和力提高起到關(guān)鍵作用，因此體外親和力成熟時(shí)可優(yōu)先考慮抗體的germline hotspots突變區(qū)域，在這些熱點(diǎn)位置進(jìn)行突變，構(gòu)建抗體小庫進(jìn)行篩選。（4）當(dāng)抗體抗原復(fù)合物的結(jié)構(gòu)被解析之后，可以通過分析兩者相互作用的位點(diǎn)信息，進(jìn)而進(jìn)行更精確的突變和建庫，有效獲得高親和力抗體序列。

展示技術(shù)廣泛用于抗體體外親和力成熟。目前常用的噬菌體表面展示和酵母表面展示技術(shù)只能展示小分子片段抗體，如抗原結(jié)合片段（Fab），單鏈可變區(qū)抗體片段（scFv）等，無法展示并篩選全長抗體。通過噬菌體和酵母表面展示技術(shù)篩選出的抗體片段，需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，將抗體的片段結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成IgG全長抗體結(jié)構(gòu)，應(yīng)用于抗體藥物開發(fā)。但是通過結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換形成的全長抗體可能會(huì)部分或全部失去對(duì)抗原的結(jié)合活性，需要對(duì)轉(zhuǎn)換后的全長抗體進(jìn)一步進(jìn)行體外成熟優(yōu)化，才能篩選出具有高親和力的抗體。

最直接的策略是通過展示IgG全長抗體，進(jìn)行體外親和力成熟優(yōu)化篩選。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)能夠有效地展示IgG全長抗體，還能夠利用真核表達(dá)系統(tǒng)指導(dǎo)抗體的正確折疊，提供人源N型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而展示的抗體在分子結(jié)構(gòu)、理化特性 和生物學(xué)功能方面最接近于天然的IgG全長抗體。但是與噬菌體展示和酵母展示技術(shù)相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)通量小，操作難度大，周期長，成本高，無法高效達(dá)到體外親和力成熟的目標(biāo)。

糖工程畢赤酵母具有類似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)量控制機(jī)制，能確?？贵w的正確折疊，具有人源N型糖基化等多種翻譯后加工功能。糖工程畢赤酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)能夠有效地展示IgG全長抗體，其表面展示的IgG抗體在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面接近于天然抗體。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)相比，糖工程畢赤酵母展示技術(shù)具有抗體庫容量大，操作簡單，周期短，成本低，能高通量篩選IgG全長抗體。糖工程畢赤酵母可以代替噬菌體、酵母細(xì)胞展示技術(shù)，構(gòu)建大容量人源IgG全長抗體庫，進(jìn)行高通量親和力體外成熟篩選，選出的高親和力、高表達(dá)IgG全長抗體不需要結(jié)構(gòu)形式改變，可以直接表達(dá)生產(chǎn)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)，是一種穩(wěn)定高效的抗體親和力成熟系統(tǒng)。因此糖工程畢赤酵母展示技術(shù)具有其他展示技術(shù)沒有的潛在優(yōu)勢。

免疫磁珠分離技術(shù)（MACs）和流式細(xì)胞分選（FACs）可以高通量篩選富集與靶標(biāo)抗原特異性結(jié)合抗體。免疫磁珠法分離細(xì)胞基于糖工程畢赤酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗體能與連接在磁珠上的抗原相結(jié)合，在外磁場中細(xì)胞通過表面展示的高親和力抗體與抗原磁珠相連被吸附而滯留在磁場中，細(xì)胞表面展示的抗體如果沒有親和力，則不能與抗原磁珠結(jié)合而沒有磁性，不會(huì)在磁場中停留。FACS分選技術(shù)可以同時(shí)根據(jù)IgG全長抗體親和力及表達(dá)展示水平進(jìn)行篩選，可以消除表達(dá)水平不同引起的偏差，而且能區(qū)分親和力不同的克隆，一次直接分選不同親和力的抗體克隆。